Исследователи получили беспрецедентную информацию о транскрипции генов
Каждая живая клетка копирует ДНК в РНК. Этот процесс начинается, когда фермент РНК-полимераза (РНКП) расщепляет ДНК. В течение нескольких сотен миллисекунд двойная спираль ДНК разворачивается, образуя узел, известный как транскрипционный пузырь, так что обнаженную цепь ДНК можно скопировать в комплементарную цепь РНК.
Как RNAP достигает этого, во многом неизвестно. Снимок РНКП, пока этот пузырь открыт, мог бы предоставить массу информации, но этот процесс происходит слишком быстро, чтобы современные технологии могли легко получить визуализацию этих структур. Теперь новое исследование было проведено в… Природа, структурная и молекулярная биология РНКП E. coli описывает процесс открытия транскрипционного пузыря.
Результаты, полученные в течение 500 миллисекунд смешивания РНКП с ДНК, проливают свет на основные механизмы транскрипции и отвечают на давние вопросы о механизме инициации и важности ее различных этапов. «Это первый раз, когда кому-либо удалось зафиксировать временные транскрипционные комплексы по мере их формирования в реальном времени», — говорит первый автор Рут Секер, специалист по исследованиям в лаборатории Сета Дарста в Рокфеллере. «Понимание этого процесса имеет решающее значение, потому что это очень важно. ключевой регуляторный этап экспрессии генов.
Беспрецедентный вид
Дарст был первым, кто описал структуру бактериальной РНКП, и попытки извлечь из нее мелкие детали оставались основным направлением его лаборатории. Хотя десятилетия работы показали, что связывание РНКП с определенной последовательностью ДНК запускает серию шагов, открывающих пузырь, до сих пор горячо обсуждается то, как РНКП разделяет цепи и помещает одну цепь в свой активный сайт.
Ранние работы в этой области предположили, что открытие пузырьков действует как критический фактор замедления процесса, определяющий, насколько быстро РНКП переходит в синтез РНК. Последующие открытия в этой области поставили под сомнение эту точку зрения, и появилось множество теорий о природе этого шага, ограничивающего скорость. «Из других биологических методов мы знаем, что когда РНКП впервые сталкивается с ДНК, она образует набор промежуточных продуктов, которые строго регулируются», — говорит соавтор Андреас Мюллер, научный сотрудник лаборатории. «Но эта часть процесса может происходить и внутри. «Меньше секунды, и мы не смогли захватить структуры за такой короткий промежуток времени».
Чтобы лучше понять эти промежуточные соединения, команда сотрудничала с коллегами из Нью-Йоркского центра структурной биологии, которые разработали автоматизированную систему на основе струйной печати, которая может быстро подготовить биологические образцы для анализа с помощью криогенной электронной микроскопии. Благодаря этому партнерству команде удалось зафиксировать соединения, которые образуются в первые 100–500 миллисекунд рекомбинации РНК, в результате чего были получены изображения четырех различных промежуточных продуктов с достаточной детализацией для проведения анализа.
Впервые получена четкая картина структурных изменений и интермедиатов, образующихся на начальных этапах связывания РНК-полимеразы с ДНК. «Технологии были очень важны для этого эксперимента», — говорит Сейкер, — «Без возможности быстро смешать ДНК и РНК-полимеразу и сфотографировать это в реальном времени, этих результатов не было бы».
Встаньте в правильное положение
Изучив эти изображения, команда смогла на беспрецедентном уровне детализации наметить последовательность событий, которая показывает, как белок RNAP взаимодействует с цепями ДНК при их разделении. По мере раскручивания ДНК белок РНКП постепенно захватывает одну из нитей ДНК, чтобы предотвратить повторное соединение двойной спирали. Каждое новое взаимодействие заставляет белок RNAP менять форму, позволяя образовывать больше связей между белком и ДНК. Это включает в себя выталкивание части белка, которая предотвращает попадание ДНК в активный сайт белка РНКП. Таким образом формируется стабильный пузырь копий.
Команда предполагает, что этапом, ограничивающим скорость транскрипции, может быть размещение цепи матрицы ДНК в активном сайте фермента РНКП. Этот шаг предполагает преодоление важных энергетических барьеров и перестановку нескольких компонентов. Будущие исследования направлены на подтверждение этой новой гипотезы и изучение других этапов транскрипции.
«Мы рассмотрели только первые шаги в этом исследовании», — говорит Мюллер, — «Затем мы надеемся рассмотреть другие комплексы, более поздние моменты времени и дополнительные шаги в цикле транскрипции».
Эти результаты не только не разрешают противоречивые теории о том, как захватываются нити ДНК, но и подчеркивают ценность нового метода, который может фиксировать молекулярные события, происходящие в течение миллисекунд, в реальном времени. Эта технология позволит проводить больше исследований такого рода, помогая ученым визуализировать динамические взаимодействия в биологических системах.
«Если мы хотим понять один из самых фундаментальных процессов в жизни, который осуществляют все клетки, мы должны понять, как регулируется его ход и скорость», — говорит Дарст. «Как только мы узнаем это, мы получим более четкое представление о том, как. транскрипция начинается».