ДНК-экспертиза и диагностика коронавируса: что такое ПЦР-тест и как он работает
Как ПЦР-исследование мазка помогает диагностировать коронавирусную инфекцию и почему иногда результат возвращается ложноотрицательным – расскажет Домашний очаг. «Общий анализ мочи, общий анализ крови, биохимия» — такой набор анализов привычен нашему уху, так как именно его чаще всего назначают терапевты. Более специфические исследования знакомы нам меньше — в том числе, и ПЦР-тест. Коронавирус изменил ситуацию: увы, слишком […]
Как ПЦР-исследование мазка помогает диагностировать коронавирусную инфекцию и почему иногда результат возвращается ложноотрицательным – расскажет Домашний очаг.
«Общий анализ мочи, общий анализ крови, биохимия» — такой набор анализов привычен нашему уху, так как именно его чаще всего назначают терапевты. Более специфические исследования знакомы нам меньше — в том числе, и ПЦР-тест.
Коронавирус изменил ситуацию: увы, слишком многие из нас столкнулись с необходимостью проходить тестирование, а потом нервно ожидать результатов. Так что же такое ПЦР-тест и как он работает?
Как расшифровывается аббревиатура ПЦР?
ПЦР — это полимеразная цепная реакция. Может показаться, что слова «цепная реакция» относятся к чему-то химическому, ядерному и взрывоопасному, но ничего подобного. В данном тестировании используется метод работы с цепочками ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислоты), отсюда и название.
При лабораторном исследовании при помощи ПЦР из очень малого образца ДНК можно быстро изготовить миллионы ее копий, чтобы распознать их и хорошенько изучить. Именно поэтому ПЦР используется для обнаружения опасных патогенов, которые могут «прятаться» от других лабораторных анализов.
Полимеразная цепная реакция произвела революцию в начале 80-х годов прошлого века, когда впервые была разработана. Ее создатель, биохимик Кэри Маллис, получил Нобелевскую премию по химии за свою работу в 1993 г.
Как работает ПЦР?
- Первым шагом ПЦР является создание праймеров. Это короткие последовательности молекул, совпадающие с концами образца ДНК, который вы пытаетесь обнаружить. Например, если вы сдаете анализ на ковид, то при исследовании будут использоваться уже готовые «хвостики» от РНК коронавируса.
- Следующим шагом в полимеразной цепной реакции становится нагревание образца. Тепло заставляет двойную спираль ДНК разделиться на две одиночные цепочки — этот процесс называется денатурацией нуклеиновых кислот.
- Температуру снижают и смешивают разделенную ДНК с праймерами. Те из них, что совпадают с концами цепочек, радостно с ними связываются, образуя шаблон.
- На следующем шаге в дело вступает ДНК-полимераза — специальный фермент, который участвует в репликации ДНК. Иными словами, это вещество контактирует с шаблоном и создает его копию (реплику). Был у нас один образец ДНК, а стало два — уже хорошо. В молекулярной биологии это называется амплификацией (от латинского лат. amplificatio — усиление, увеличение).
- Образец еще раз нагревается, ДНК снова разделяется на цепочки — и весь процесс повторяется. Из двух спиралей ДНК мы получаем четыре, потом восемь, шестнадцать — и так до тех пор, пока количества генетического материала не станет достаточно. Как правило, нужно от 20 до 40 циклов для понимания, присутствует ли ДНК искомого патогена.
Все этапы полимеразной цепной реакции — денатурация ДНК, нанесение праймеров и удлинение ДНК — происходят при различных температурах. Это означает, что после формирования «исходной смеси» шаги можно контролировать с помощью процесса, известного как «термоциклирование».
Термоциклирование означает, что температура поддерживается на необходимом уровне ровно столько, сколько требуется для выполнения каждого шага. С использованием специального оборудования участие человека минимально, а точность анализа очень высока.
Где применяют ПЦР-метод?
Сфера применения полимеразной цепной реакции очень обширна и не ограничивается только определением инфекции:
- клонирование ДНК для секвенирования генома
- клонирование генов
- филогенез (изучение исторического развития организмов)
- диагностика наследственных заболеваний
- изучение древней ДНК
- анализ «генетических отпечатков пальцев» (для ДНК-профилирования)
- определение родительства
- криминалистические исследования и т.д.
Как работает ПЦР-тест для диагностики коронавируса?
Анализ для определения коронавирусной инфекции проходит так же, как и для любого другого патогена.
У человека берется мазок из носоглотки, чтобы определить, присутствует ли на слизистых РНК вируса. При положительном результате заболевший опасен для окружающих, а значит, должен отправиться на карантин.
Как подготовиться к сдаче ПЦР-мазка на коронавирус?
За три часа до сдачи ПЦР-анализа нельзя есть и пить, чистить зубы, использовать полоскания и спреи, жевать жвачку, курить и рассасывать таблетки.
В лаборатории вам потребуется паспорт и медицинский полюс.
Какова точность ПЦР-тестирования на коронавирус?
Исследование, проведенное в американском Университете Джона Хопкинса и опубликованное в августе 2020 года показало, что каждый пятый проведенный ПЦР-тест является ложноотрицательным.
По теме: Не только коронавирус: как не заболеть простудой и гриппом этой осенью
Показатели точности зависят от стадии инфекции, причем самый высокий процент ложноотрицательных результатов регистрируется в первые четыре дня после заражения. Если тестирование происходит на восьмой день инфекции (обычно — через три дня после появления симптомов), результаты более точны.
Как проходит исследование?
Чтобы оценить точность теста, ученые проанализировали данные семи предыдущих исследований, в ходе которых было изучено 1330 мазков из носоглотки пациентов. Затем специалисты сравнили данные ПЦР-тестов с историей контактов и временем появления симптомов у пациентов. Вот, каким было количество ложноотрицательных результатов:
- В первый день после заражения — 100%
- На четвертый день — 67%
- На пятый день — 38%
- На восьмой день — 20%
После восьмого дня точность тестов снова начала снижаться. Иными словами, при коронавирусе ПЦР-тестирование эффективно в довольно узком «окне» — слишком рано пройденный тест ничего не покажет так же, как и слишком поздно пройденный, даже при наличии симптомов.
По теме: Коронавирус или нет: могли ли вы переболеть COVID-19, не зная об этом
Если вы знаете, когда могли заразиться, то попробуйте пройти тестирование примерно на 8 день после этой даты — или на третий после появления симптомов. И если результат будет отрицательным при наличии очевидных признаков коронавирусной инфекции, то лучше не рискуйте и оставайтесь дома, пока симптомы полностью не исчезнут.
Почему ПЦР-тесты на ковид не всегда точны?
Исследователи говорят, что одной из причин большого числа ложноотрицательных результатов может быть вариабельность выделения вируса. Тест проведен слишком рано? Вирус может не успеть выделиться в рото- и носоглотке. Слишком поздно? Вирус «спустился» ниже, в бронхи и легкие.
Неверными могут быть и методы отбора проб — например, если мазок взяли недостаточно «глубоко», или если пациент перед анализом выпил воды. Проблема может быть также в недостаточно качественных реагентах.
Как диагностируют коронавирус, если тест пришел ложноотрицательным?
Врачам помогает оценка симптомов, поиск маркеров воспаления (например, С-реактивного белка), компьютерная томография грудной клетки и проведение иммуноферментного анализа на антитела к коронавирусу.