«От оргазма до бессмертия: Записки драг-дизайнера»
Сколько времени уходит на разработку лекарств? Почему далеко не каждая удачная идея превращается в таблетки? В книге «От оргазма до бессмертия: Записки драг-дизайнера» (издательство «Дискурс») биофизик, доктор биологических наук Григорий Никифорович описывает тернистый путь, который проходят новые препараты. Оргкомитет премии «Просветитель» включил эту книгу в «длинный список» из 24 книг, среди которых будут выбраны финалисты и лауреаты премии. N + 1 предлагает своим читателям ознакомиться с отрывком, в котором рассказывается о концепции биологически активной конформации и о том, почему сведения о пространственных структурах рецепторов означали революцию в драг-дизайне.
Самая интересная конформация
Вот уже несколько раз упоминалось, что у активных аналогов пептидов циклизация закрепляет «правильную» трехмерную структуру. Именно эта конформация узнается молекулами, с которыми пептиды связываются — рецепторами, — в результате чего запускается каскад биохимических реакций, который приводит к тому или иному физиологическому эффекту. Поэтому знание «правильной» конформации данного пептида очень важно для направленного драг-дизайна.
Драг-дизайнеры поняли это давно и даже заблаговременно дали название такой конформации: биологически активная, или конформация на рецепторе (receptor-bound). Выяснить пространственное строение биоактивной конформации данного пептида можно, сравнив наборы возможных трехмерных структур нескольких активных и неактивных аналогов: у всех активных аналогов в них найдется биоактивная конформация, а у неактивных она будет отсутствовать. Из-за гибкости коротких пептидных цепочек в растворе экспериментальные методы, дающие представление лишь об усредненных структурах аналогов, здесь не подойдут. Остаются методы теоретические — конформационные расчеты.
И поскольку такая технология в нашей группе была налажена, модели биологически активных конформаций энкефалина, ангиотензина и других пептидов не заставили себя ждать. Тогда мы базировались в основном в Риге, в Институте органического синтеза, и наши коллеги, пептидные химики активно использовали эти модели для синтеза новых аналогов. Во многих случаях — но не всегда — им сопутствовал успех. Расчетные модели с предсказаниями тех же конформаций для тех же пептидов появились и за рубежом; по большей части — но, опять-таки, не всегда — они совпадали с нашими.
Сама же концепция расчета биоактивной конформации пептида с помощью сравнения наборов низкоэнергетических структур активных и неактивных его аналогов вызвала большой интерес и широко утвердилась. На нашу первую статью на эту тему в журнале FEBS Letters (в 1978 году одолеть бюрократические барьеры в Латвии оказалось легче, чем в Белоруссии) откликнулись многие исследователи со всего мира. В те времена ознакомиться с текстом статьи можно было, прислав автору просьбу выслать оттиск — не по электронной, а по обычной почте. Таких запросов пришло более двухсот; мы повесили на стене карту мира и отмечали на ней адреса, откуда они были отправлены — из Европы, США, Австралии, Азии, Южной Америки и даже из Африки. О том, чтобы самим побывать в этих местах, нам, провинциалам, нечего было и мечтать.
Поделиться
Концепция концепцией — но прямого эксперимента, подтверждающего, что именно благодаря конформации пептид выбирает взаимодействие с тем или иным специфическим рецептором, поставлено не было. Мы провели его только через несколько лет, когда я работал уже в Сент-Луисе. Первые четыре аминокислоты заинтересовавшего нас линейного семичленного пептида напоминали последовательность энкефалина, а о фрагменте, состоящем из четырех последних аминокислот (фрагменты пересекались), было известно, что он обладает эффектом холецистокинина, пептида, регулирующего выброс желчи в кишечник. В положениях 2 и 5 этого пептида разместили неприродные аминокислоты; тем не менее он прочно связывался с рецепторами холецистокинина, не обращая внимания на опиоидные рецепторы, с которыми взаимодействует энкефалин. Но как только боковые цепи в положениях 2 и 5 чуть-чуть модифицировали и замкнули валентную связь между ними, получившееся циклическое соединение столь же прочно связалось с опиоидными рецепторами, игнорируя рецепторы холецистокинина. При этом по химическому строению линейный пептид от циклического отличался минимально: лишь одна функциональная группировка была заменена на другой атом.
Разумеется, до того как планировать синтез нового пептида, конформационные расчеты подтвердили, что цикл 2–5 способен принять пространственную структуру, подобную предсказанной ранее биологически активной конформации энкефалина. Вообще, эта работа еще раз продемонстрировала необходимость тесного сотрудничества расчетчиков, химиков и биологов из разных лабораторий и даже разных стран. Впрочем, слово «даже» тут неуместно: ведь нет науки белорусской, латышской, российской или американской — наука едина и только единой и может существовать. В данном случае расчеты и химический синтез были проведены у нас в Вашингтонском университете Сент-Луиса; там же, но на другой кафедре, прошла часть биологических испытаний; а остальные испытания осуществлялись в Канаде (Монреальский университет) и Франции (Университет в Монпелье). При этом участники руководствовались не меркантильными интересами — разве что возможностью опубликовать совместную статью, — а научным любопытством и, хотелось бы думать, взаимной симпатией.
Во Франции нашим партнером был профессор Жан Мартинец, крупный пептидный химик и биолог, патриот Лангедока, области на юге Франции, где расположен город Монпелье со своим университетом, основанным еще в Средние века. Тогда особенно славился его медицинский факультет, где в свое время учились знаменитый предсказатель Нострадамус и великий писатель Франсуа Рабле. Когда я гостил в доме Жана Мартинеца и обед заканчивался традиционным блюдом сыра, хозяин с гордостью рассказывал о разнообразии сыров, производимых в окрестностях Монпелье, — каждый день года можно пробовать другой сорт. Мы вместе отправились на очередной Европейский пептидный симпозиум, который в тот раз происходил в Швейцарии, но, подъехав к границе, Жан остановил автомобиль и предложил перекусить, пока мы еще во Франции. «А то ведь в Швейцарии вкусной еды не найти», — сказал он. Я решил поддразнить его и вспомнил про знаменитый швейцарский сыр. «Ну какой это сыр, — серьезно ответил он. — Одни дырки!»
Поделиться
К началу двадцать первого столетия представление о биологически активной конформации было центральным в драг-дизайне пептидов. Вновь синтезированные аналоги старались воспроизвести ее, поскольку считалось, что именно она реализуется на поверхности рецептора. Однако так ли это на самом деле, не знал никто: слишком мало было известно о второй половинке пары «пептид-рецептор» — о рецепторе. По существу, в силе оставались еще положения основателя фармакологии Пауля Эрлиха о том, что лекарство непосредственно действует лишь на некоторые вполне определенные точки на поверхности клетки, начиная с которых его эффект распространяется на всю клетку и далее — на весь организм. (В 1908 году Эрлих — совместно с Ильей Мечниковым — был удостоен Нобелевской премии за работы по иммунологии.) Такие точки и называли рецепторами — без особой детализации их химического состава и механизма действия. Примерно на таком же уровне использовался этот термин и в драгдизайне XX века.
А когда стало, наконец, ясно, что рецепторы — это отдельные белковые молекулы или их комплексы, и когда удалось установить их пространственные особенности, драг-дизайн получил новый импульс к развитию.
Наконец-то рецепторы
Те, кто читал произведения писателя и публициста Александра Солженицына (тоже, между прочим, лауреата Нобелевской премии — никуда от нее не деться в нашем сочинении), опознали, быть может, заголовок одного из разделов его многотомного «Красного колеса»: восторженное восклицание «Наконец-то революция!». Действительно, сведения о пространственных структурах рецепторов означали революцию в драг-дизайне — ведь теперь появилась возможность направленного конструирования молекул лекарственных средств с учетом конформаций не только их самих, но и взаимодействующих с ними рецепторов.
Некоторые лекарства действуют в организме прямым способом — например, аспирин (ацетилсалициловая кислота), изменяющий кислотно-щелочной баланс крови, или некоторые антибиотики, буквально разъедающие мембрану бактерий. Но большинство лекарственных препаратов вызывает физиологическую реакцию, лишь связавшись предварительно с рецепторами. По оценкам 2018 года, около 35 процентов всех лекарств, разрешенных к применению в США и Европе (не менее семисот наименований), действуют через так называемые рецепторы, сопряженные с G-белками, — о них в дальнейшем будет говориться весьма подробно. Вторым по величине классом рецепторов для уже существующих лекарств являются ферменты киназы (30 процентов); за ними следуют ионные каналы (18 процентов) и так называемые ядерные рецепторы (16 процентов). Все это — белки или комплексы белков. Пространственные структуры их молекул — при условии, что они известны, — могут выполнять в драгдизайне роль мишеней для поиска новых соединений лигандов, предположительно взаимодействующих с ними.
Эта новая постановка задачи драг-дизайна в каком-то смысле напоминает ситуацию, возникшую с появлением пептидных библиотек, синтетических или фаговых. Если раньше драг-дизайнеры подбирали структуру соединения, оптимальную для данной биологической функции, то теперь они получили возможность находить биологические функции, свойственные (или нет) соединениям с данной структурой. Точно так же, если раньше оптимальная конформация пептидного лиганда определялась лишь по косвенным результатам биологического тестирования, теперь ее можно было подобрать по соответствию заранее известным моделям белковых мишеней.
Первыми были определены трехмерные структуры белков из семейства киназ — еще в конце семидесятых годов. Но настоящее их использование в драг-дизайне началось только в новом столетии. Знание пространственной структуры мишени позволило проводить процедуру молекулярного докинга — компьютерной стыковки молекул мишени и лиганда с расчетом энергии взаимодействий во всех возможных расположениях этой пары. Предполагалось, что реальная модель комплекса двух молекул должна соответствовать их расположению с наименьшей энергией.
С вычислительной точки зрения процедура докинга более сложна, чем обычные конформационные расчеты. Дело в том, что общая энергия взаимодействия двух молекул должна включать еще и внутримолекулярные энергии каждой из них. Но под воздействием первой молекулы конформация второй может измениться и, наоборот, вторая молекула будет влиять на первую. К тому же эти воздействия будут разными в зависимости от взаимного расположения молекул. Одним словом, снова оказалось невозможным обойтись без уже привычного средства — дальнейшего упрощения выражений для расчета энергии.
И их упростили — до такой степени, что рассчитывали уже не энергию, а некую условную скоринг-функцию, численную оценку стабильности комплекса «мишень-лиганд» при разных взаимных расположениях обеих молекул. Зато просмотр всех возможных расположений лиганда относительно мишени производился достаточно быстро, и можно было осуществить докинг большого количества потенциальных лигандов при сравнительно небольших затратах вычислительных ресурсов. Наилучшие значения скоринг-функций для каждого из лигандов затем, в свою очередь, ранжировались, и те лиганды, которые занимали первые места, рекомендовались химикам для синтеза. О скрининге — массовом тестировании большого количества химических соединений для отбора лучшего из них по физиологическому эффекту или по связыванию с рецептором — уже говорилось ранее. Описанную процедуру компьютерного докинга большого количества химических соединений с отбором наиболее перспективных лигандов для заданной мишени называют виртуальным скринингом. И докинг, и виртуальный скрининг сейчас прочно вошли в арсенал драг-дизайнеров, благо различные виды компьютерных программ для докинга легко найти на интернете. Последний по времени из известных мне примеров виртуального скрининга (февраль 2019 года) проанализировал ни много ни мало — сто семьдесят миллионов соединений.
А в научном русскоязычном жаргоне укоренились новые англоамериканизмы: скрининг, скоринг, докинг… И это объяснимо: краткий иноязычный термин использовать удобнее, чем многословное отечественное описание метода, ранее вовсе не существовавшего. Например, «скоринг», процесс присвоения каждому взаимному пространственному расположению лиганда и мишени цифровой характеристики, по которой и проводится в дальнейшем их классификация, — русский эквивалент этому слову вряд ли найдется. С другой стороны, «отбор» ничем не отличается от «скрининга», а «докинг» уже пытаются заменить выражением «молекулярная стыковка». Однако во времена, когда «товароведа» окончательно вытеснил «мерчандайзер», эти попытки вряд ли окажутся успешными — и можно долго дискутировать, хорошо это или плохо для языка российского научного сообщества.
Как и для русского языка в целом. Процесс заимствования идет непрерывно, в основном из-за появления новых понятий. Передать по-русски понятия «смартфон» или «рэпбаттл» не то чтобы невозможно, но нерационально, как когда-то нерациональными оказались «мокроступы» вместо «калош». С другой стороны, слово уходит из языка с исчезновением понятия, его обозначающего. Уцелеют ли докинг со скринингом после новой, еще неведомой нам революции в драг-дизайне — а она неизбежна, — пока неизвестно. Двести лет назад Александр Сергеевич Пушкин вынужден был оправдываться за излишнее употребление иностранных терминов — он писал в «Евгении Онегине»: «Но панталоны, фрак, жилет. / Всех этих слов на русском нет». Сегодня их тоже нет: панталоны исчезли, а фраки заменили смокингами — за редкими исключениями. Жилеты, правда, пока уцелели.
Поделиться
Впрочем, не будем застревать на терминологии и вновь обратимся к основной задаче драг-дизайна в новую эру: подобрать лиганд, эффективно взаимодействующий с пространственной структурой белковой мишени. Рентгеноструктурный анализ, ядерный магнитный резонанс, криоэлектронная микроскопия — все эти экспериментальные подходы сегодня в распоряжении драг-дизайнера. Если же по каким-то причинам молекулярную модель мишени не удается установить экспериментально, можно воспользоваться вычислительными методами. Идея гомологичного (гомологического) моделирования (или моделирования по гомологии) белков предполагает, что молекулы белков, принадлежащие к родственным эволюционным семействам и имеющие схожие аминокислотные последовательности, будут обладать и похожими пространственными структурами. А раз так, то можно воспроизвести еще не определенную экспериментально конформацию белка, уложив его аминокислотную последовательность на трехмерный «шаблон» родственного белка с уже известной трехмерной структурой. Это не так легко, но многие компьютерные программы — опять-таки, доступные в интернете — с этой задачей справляются. Там же, в интернете, существует и обширная коллекция шаблонов: в Банке данных о белках (Protein Data Bank, PDB) на сегодняшний день (в феврале 2019 года) содержится более ста тридцати семи тысяч пространственных структур белков и их фрагментов.
Но белковых структур, имеющих отношение к самому большому классу мишеней для существующих лекарств — рецепторам, связанным с G-белками, — в Банке всего около трехсот. Между тем этот класс белков наиболее интересен для драг-дизайна: напомним, 35 процентов лекарственных препаратов связываются именно с ними. Огромные белковые молекулы (в их цепочках насчитывается от трех до пяти сотен звеньев) пронизывают толщу клеточной мембраны и служат как бы посредниками между тем, что происходит снаружи клетки, и тем, что происходит внутри. Лекарства связываются с той их частью, что расположена с внешней стороны мембраны, а части рецепторов, доступные с внутренней стороны, взаимодействуют с комплексами особых G-белков, которые и инициируют разнообразные биохимические реакции уже в самой клетке. Как именно функционирует весь этот молекулярный механизм, пока ясно не во всех деталях; но известно стало уже многое.
Подробнее читайте:
Никифорович, Г. От оргазма до бессмертия: Записки драг-дизайнера / Григорий Никифорович. — Минск: Дискурс, 2019. — 176 с.